Der Sohn eines Lehrers studierte zunächst 1930 und 1931 in München vier Semester Philosophie, Germanistik und Theaterwissenschaften. Nebenbei nahm er privaten Schauspielunterricht bei Hans Schlenck in München und debütierte dort 1932 am Theater der Gegenwart. Es folgten Bühnenengagements in Heidelberg, Königsberg, Bonn, Bremen, Stuttgart und Berlin. 1942 debütierte er zudem – von der Wehrmacht eigens dafür freigestellt – als Filmschauspieler in der UFA-Produktion Die große Liebe neben Zarah Leander.

Nach Ende des Zweiten Weltkrieges arbeitete Preiss zunächst wieder am Theater sowie seit 1949 umfangreich in der Synchronisation. 1954 kehrte er zum Film zurück, als Alfred Weidenmann ihn in seiner Kinoproduktion Canaris als Offizier besetzte. Im Folgejahr stellte Preiss in Falk Harnacks Produktion über das Hitler-Attentat Der 20. Juli Claus Graf Schenk von Stauffenberg dar. Diese Rolle bescherte ihm große Popularität und brachte ihm 1956 als Bundesfilmpreis das Filmband in Silber ein.

Fortan war Preiss auf Rollen aufrechter und pflichtbewusster Offiziere festgelegt, ähnlich wie sein Kollege Wolfgang Büttner, u.a. in Hunde, wollt ihr ewig leben von Frank Wisbar, in Haie und kleine Fische und in Die grünen Teufel von Monte Cassino. Auch in zahlreichen internationalen Produktionen, vorwiegend in Italien und den USA, spielte Preiss Rollen aufrechter Soldaten oder pflichtbewusster Nazi-Offiziere. In aufwändigen und starbesetzten Großproduktionen wie Der längste Tag (1962) und Die Brücke von Arnheim (1976) von Richard Attenborough war er ebenfalls zu sehen, unter der Regie von Otto Preminger in Der Kardinal (1963), neben Jean-Paul Belmondo in Der Boss hat sich was ausgedacht (1964) und in Brennt Paris? (1966). 1964 war er neben Burt Lancaster in Der Zug (The Train) unter der Regie von John Frankenheimer zu sehen und 1965 in Colonel von Ryans Express neben Frank Sinatra sowie in Die Schlacht von Anzio neben Robert Mitchum und als Erwin Rommel neben Richard Burton in Jagd auf Rommel.

Für das bundesdeutsche Kinopublikum wurde er durch seine Rolle als Dr. Mabuse zum Inbegriff des größenwahnsinnigen Wissenschaftlers, die er 1960 (in der Nachfolge von Rudolf Klein-Rogge) das erste Mal unter Fritz Lang verkörperte, der 1922 bereits den ersten Dr. Mabuse-Film gedreht hatte. Damit die Zuschauer seinerzeit im Fim nicht zu früh den bekannten Schauspieler als Bösewicht entlarven konnten, wurde er in Filmzeitschriften in der Rolle lediglich als Prof. Jordan angekündigt, wohingegen für eine deutsch-italienische Co-Produktion ein Lupo Prezzo (eine bloße Übersetzung seines Namens ins Italienische) angekündigt wurde. In den folgenden drei Jahren übernahm Preiss noch drei weitere Male die Rolle des Mabuse, wobei sich seine Rolle auf Gastauftritte gegen Ende des Filmes beschränkte, jeweils wenn Mabuse entlarvt wurde. In den beiden letzten Filmen der Reihe, Scotland Yard jagt Dr. Mabuse und Die Todesstrahlen des Dr. Mabuse, trat er schließlich gar nicht mehr auf, obwohl auf den Kinoplakaten mit seinem Namen geworben wurde.

In den 80er Jahren spielte Preiss überwiegend in Fernsehproduktionen, so den mit der Putzfrau Mrs. Harris befreundeten Earl in den gleichnamigen Filmen mit Inge Meysel sowie den Generalfeldmarschall Walther von Brauchitsch in den amerikanischen TV-Serien Der Feuersturm (The Winds of War) und Feuersturm und Asche (War and Remembrance) nach den Romanen von Herman Wouk. 1987 erhielt er für sein künstlerisches Schaffen ein zweites Mal den Bundesfilmpreis: Für sein langjähriges und hervorragendes Wirken im deutschen Film wurde er mit dem Filmband in Gold geehrt.

Als Synchronsprecher lieh Wolfgang Preiss seine Stimme so prominenten Kollegen wie Lex Barker (in Klar Schiff zum Gefecht), Christopher Lee (in Port Afrika), Anthony Quinn (in Buffalo Bill), Claude Rains (in Der Prinz und der Bettelknabe und in Mit eiserner Faust), Richard Widmark (in Seemannslos) sowie Conrad Veidt als Major Strasser in der Neusynchronisation von Casablanca.

Wolfgang Preiss verstarb 2002 im Alter von 92 Jahren in einer Klinik auf der Bühlerhöhe bei Baden-Baden. Seine letzte Ruhestätte befindet sich auf dem Hauptfriedhof der Stadt Baden-Baden.

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